| 出品公司: | 生物风 |
|---|---|
| 感受态细胞名称: | DH5α λpir Ultracompetent cells；DH5α λpir |
| 菌种类型: | E.coli |
| 产品规格: | 10X100 微升 |
| 转化效率: | 大于1X10的9次方 |
| 基因型: | F- φ80 lac ZΔM15 Δ(lacZYA-arg F) LAMpir U169 endA1 recA1 hsdR17(rk-,mk+) supE44λ- thi -1 gyrA96 relA1 phoA |
| 质粒转化条件: | 42 ℃热激 |
| 生长条件: | 37 ℃, 有氧 |
| 用途: | 非毒性蛋白表达。 |
| 储存条件: | -80 ℃或者更低温度保存，避免反复冻融。 |
感受态细胞特点和简介
生物风生产的DH5α λpir感受态细胞是采用大肠杆菌DH5α λpir经过特殊工艺处理得到的感受态细胞，可以用于质粒的化学转化。使用pUC19质粒检测，转化效率可以高达108 CFU/ug，-70 ℃保存几个月转化效率也不发生改变。
大肠杆菌DH5α λpir生长速度快，表达量高，是原核细胞蛋白表达最基础的菌株；
蛋白酶Lon和OmpT的缺陷型，能够有效减少对目的蛋白的降解；
适合IPTG诱导的T7启动子载体，常用的pET系列载体；
表达非毒性蛋白，有密码子偏好性。
大肠杆菌DH5α λpir生长速度快，表达量高，是原核细胞蛋白表达最基础的菌株；
蛋白酶Lon和OmpT的缺陷型，能够有效减少对目的蛋白的降解；
适合IPTG诱导的T7启动子载体，常用的pET系列载体；
表达非毒性蛋白，有密码子偏好性。
感受态细胞制备方法
DH5α λpir菌株来源于DH5α，在DH5α大肠杆菌基因组中引入LAMpir，即为DH5α λpir，该菌株可以表达 PIR蛋白，使得含有R6Kg ori复制子的质粒可以在其中正常复制。 DH5α λpir菌株缺失核酸内切酶 (endA)，提高了质粒DNA的产量和质量；重组酶缺陷型 (recA)减少插入片段的同源重组概率，保证了插入DNA 的稳定性；lacZΔM15的存在使DH5α可用于蓝、白斑筛选；但DH5α λpir菌株生长速度较慢，在平板培养或液体摇菌时应延长生长时间。唯地生物开发的DH5α λpir感受态细胞经特殊工艺制作，pUC19质粒检测转化效率>1×109 cfu/μg DNA。
感受态细胞操作方法
1. 取DH5α λpir感受态细胞置于冰浴中，如需分装可将刚融化细胞悬液分装到无菌预冷的离心管中，置于冰浴中。
注意：一次转化DH5α λpir感受态细胞的建议用量为 50-100μl，可以根据实际情况分装使用。应注意所用DNA 体积不要超过感受态细胞悬液体积的十分之一。以下实验以100μl DH5α λpir感受态细胞为例。
2. 向DH5α λpir感受态细胞悬液中加入目的 DNA (100μl 的感受态细胞能够被1 ng 超螺旋质粒DNA 所饱和），轻弹混匀，在冰浴中静置30 分钟。
3. 将离心管置于 42 ℃ 水浴中放置60-90秒，然后快速将管转移到冰浴中，使DH5α λpir感受态细胞冷却2-3分钟，该过程不要摇动离心管。
注意：此步骤也可将离心管置于室温进行，时间不需十分准确，夏季或室温较高时，可放置5-8分钟左右；如果室温较低，可延长时间至8-15分钟左右。条件允许建议使用 42 ℃ 热激方法。
4. 向每个离心管中加入900 μl无菌的SOC 或LB 培养基（不含抗生素），混匀后置于37 ℃摇床振荡培养45 分钟（150 rpm），目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。
5. 将离心管内容物混匀，吸取100μl已转化的DH5α λpir感受态细胞加到含相应抗生素的SOB或者LB 固体琼脂培养基平板上，用无菌的弯头玻棒涂布器或玻璃珠将细胞均匀涂开。将平板置于室温直至液体被完全吸收后，倒置平板，37 ℃培养12-16 小时。
注意：涂布用量可根据具体实验来调整。如转化质粒总量较多，可取更少转化产物涂布平板；反之，如转化的质粒总量较少，可取200-300 μl转化产物涂布平板；对于连接产物的转化菌液，可以通过离心（4000 rpm，2分钟）后倒掉大部分培养液上清，吹打悬浮菌体后，将其涂布于一个平板中。
6. 涂布剩余的菌液可置于 4℃冰箱中保存，如果次日的转化菌落数过少，可以将剩下的菌液再涂布新的培养平板。
感受态细胞注意事项
1. DH5α λpir感受态细胞应保存在-70 ℃，不可反复冻融和放置时间过长，以免降低感受态细胞的转化效率。
2. 进行转化操作时，应根据相应的温度及无菌条件的要求进行。
3. 为防止转化实验不成功，可以保留部分连接反应液，以重新转化，将损失降到最低。
4. 用于转化的连接产物或质粒的体积不能超过感受态细胞体积的15%.
5. 质粒超过7.5 kb后，随尺寸的增加转化效率会下降，质粒的尺寸超过10 kb时，在大肠杆菌增殖过程中也可能会出现质粒缺失现象；
6. 用于转化的质粒量在0.1 pg~50 ng间的效果最好，超过50 ng质粒时，平板上单克隆数目会增加，但是转化效率会下降。
7. 42 ℃热击时间与离心管的厚度、菌液的体积、转入片段的大小直接相关，一般建议热击60-90秒，热击时间不宜超过90秒，否则转化效率会下降很快；
